Key learning objectives

• Advantages of measuring biomolecular interactions in solution by MDS and how to use this technology in measuring affinity and concentration of an unpurified membrane-protein target in a complex background
• Workflow and timings of a purification-free method for the extraction of integral membrane proteins from cellular membranes without disrupting their local lipid-bilayer environment by using native nanodiscs
• Case-study results on obtaining both the absolute cellular concentration and the antibody affinity of the HER2 oncoprotein embedded in native nanodiscs yielded by MDS technology

Purification-free affinity and concentration measurement of membrane-protein targets

This webinar introduces an integrated preparative and analytical method that enables researchers to simultaneously measure:

• The concentration of an endogenous membrane-protein target
• Its binding affinity to a specific ligand in a native lipid-bilayer environment directly extracted from crude cellular membranes

To demonstrate this approach, Sebastian Fiedler and Sandro Keller will describe how the nanodisc-forming polymer, Glyco-DIBMA, was used to create a native membrane-protein library of a breast cancer cell line. They will discuss how microfluidic diffusional sizing (MDS) on the Fluidity One-M, was then used to determine both the concentration of the endogenous oncoprotein HER2 and its affinity to trastuzumab, a therapeutic HER2-specific antibody. The combination of native membrane-protein libraries with MDS provides quantitative information on membrane proteins without the need for laborious and costly protein-purification campaigns. The method is straightforward to adapt in standard research laboratories, takes only a few hours to complete, and has the potential to be expanded from cell lines to tissues and tumor biopsies

ITALIANO.

Principali obiettivi di apprendimento

Vantaggi della misurazione delle interazioni biomolecolari in soluzione mediante MDS e come utilizzare questa tecnologia per misurare l'affinità e la concentrazione di un bersaglio proteico di membrana non purificato in uno sfondo complesso

Flusso di lavoro e tempi di un metodo privo di purificazione per l'estrazione di proteine integrali di membrana dalle membrane cellulari senza interrompere il loro ambiente locale a doppio strato lipidico utilizzando nanodischi nativi

Risultati del caso di studio sull'ottenimento sia della concentrazione cellulare assoluta che dell'affinità anticorpale dell'oncoproteina HER2 incorporata nei nanodischi nativi ottenuti dalla tecnologia MDS

Informazione

Affinità senza purificazione e misurazione della concentrazione di bersagli proteici di membrana

Questo webinar introduce un metodo preparatorio ed analitico integrato che consente ai ricercatori di misurare simultaneamente:

La concentrazione di un bersaglio proteico di membrana endogeno

La sua affinità di legame con un ligando specifico in un ambiente nativo a doppio strato lipidico estratto direttamente dalle membrane cellulari grezze

Per dimostrare questo approccio, Sebastian Fiedler e Sandro Keller descriveranno come il polimero che forma nanodischi, Glyco-DIBMA, è stato utilizzato per creare una libreria di proteine di membrana nativa di una linea cellulare di cancro al seno. Discuteranno di come il dimensionamento diffusionale microfluidico (MDS) sul Fluidity One-M è stato quindi utilizzato per determinare sia la concentrazione dell'oncoproteina endogena HER2 sia la sua affinità con il trastuzumab, un anticorpo terapeutico specifico per HER2. La combinazione di librerie native di proteine di membrana con MDS fornisce informazioni quantitative sulle proteine di membrana senza la necessità di laboriose e costose campagne di purificazione delle proteine. Il metodo è semplice da adattare nei laboratori di ricerca standard, richiede solo poche ore per essere completato e ha il potenziale per essere esteso dalle linee cellulari ai tessuti ed alle biopsie tumorali